Исследование проб. Часть 2
Морфология
Процентное содержание сперматозоидов в образце должно соответствовать норме. Морфологическое исследование можно проводить и на мокрых препаратах, но необходимы фиксация и окрашивание спермы. Виды красителей, включая краситель Гимзы, описаны выше. Можно воспользоваться самым простым методом, который позволит одновременно изучать морфологию сперматозоидов и целостность мембран, этот метод называется витальным окрашиванием.
Для витального окрашивания используют простой краситель нигрозинэозин (его лучше хранить в холодильнике).Эозин впитывается клетками, которые к моменту окрашивания были уже мертвы (из-за поврежденных мембран), и они приобретают розовый цвет. Нигрозин обеспечивает фоновое окрашивание, благодаря чему становятся отчетливо видны сперматозоиды, их форма; нигрозин дает фиолетово-голубое окрашивание.
Сперматозоиды белого цвета считаются живыми; мембраны их не повреждены, поэтому они не впитали эозин.
Замечание: головка сперматозоида по бокам не скруглена, то есть имеет форму ракетки для настольного тенниса.
Подготовка пробы к морфологическому исследованию при помощи нигрозин-эозина
Закапывают семь капель нигрозин-эозина в пробирку и согревают в теплой ванночке в течение 2 минут. Добавляют каплю семени (после чего перемешивают, поскольку сперматозоиды оседают на дно). Сразу после этого свежей пипеткой наносят одну каплю окрашенного семени на чистое предметное стекло. Другим стеклом, которое держат под углом 45°, размазывают эту каплю тонким слоем, как это делается при приготовлении мазка для гематологического исследования. Дают мазку высохнуть (обычно это происходит достаточно быстро).
Исследуют препарат при стократном увеличении, используя жидкую смазку; если сперматозоиды буквально лежат друг на друге, то следует приготовить другой мазок с использованием большего количества красителя, если же сперматозоиды очень редки, то для другого мазка надо взять меньшее количество красителя.
Сперматозоиды хорошо вырисовываются на темном (нигрозиновом) фоне. Сто сперматозоидов были исследованы и классифицированы как живые нормальные и мертвые аномальные.
Классификация аномальных сперматозоидов
Аномалии сперматозоидов можно разделить на три категории:
- первичные, возникшие в процессе сперматогенеза;
- вторичные, возникшие во время эпидидимальной стадии развития;
- третичные, появившиеся в процессе забора и обработки пробы.
Классификация аномалий помогает выяснить происхождение последних и предоставить информацию относительно вероятности оплодотворения. В стандартных учебниках приводятся таблицы первичных, вторичных и третичных аномалий сперматозоидов.
К наиболее распространенным аномалиям относятся следующие:
- аномалии головки: поднятые (эдематозные) акросомы, шишковатые акросомы, кратерный дефект;
- аномалии шейки: согнутая шейка, сломанная шейка;
- аномалии средней части: проксимальная цитоплазматическая капля, болтающийся конец шейки (разорванная митохондрия);
- аномалии хвостика: дистальная цитоплазматическая капля (обычно считается нормальной), согнутый хвостик, свернутый кольцами хвостик;
- в сперматозоиды, которые к моменту окрашивания были мертвы, проник эозин, окрасив их в розовый цвет.
Замечание: некоторые нигрозин-эозиновые красители могут вызывать аномалии хвостика.
В эякуляте здоровой собаки содержится свыше 80 % морфологически нормальных живых сперматозоидов.
Другие тесты
Для исследования сперматозоидов применяются и другие тесты, в частности гипоосмотическое тестирование вздутий (тест на функциональную целостность мембраны сперматозоидов) и анализ проникающей способности спермы.
Хранение проб
Некоторое количество проб следует помещать в буферный солевой раствор (в пропорции примерно 1:1), запечатывая воском горлышко бутылки, чтобы предотвратить испарение, и надписывая этикетку; при любых сомнениях это позволит провести ретроспективное исследование.
